蛋白濃縮和換Buffer通常使用的
超濾管，選擇合適的超濾管，主要考慮MWCO和濃縮體積，通常應(yīng)截留分子量不應(yīng)大于目的蛋白分子量的1/3，若目的蛋白分子量為10kD左右，則可以用截留分子量3kD的超濾管。
使用前加入MilliQ水，水量*過膜，冰浴或冰箱里預(yù)冷幾分鐘。然后將水倒出，即可加入蛋白液，加入的多少，以不超過管頂?shù)陌拙€為準(zhǔn)。操作要輕，加入蛋白液前，超濾管需要插在冰上預(yù)冷。當(dāng)濃縮到剩下1ml時(shí)，取50ul國產(chǎn)Bradford溶液，加入10ul流穿，看有沒變藍(lán)色，以此判斷超濾管是否漏掉蛋白。如果管漏了，將上層和流穿重新倒入新管中開始超濾。要判斷是否漏管，用5mg/ml的BSA離心10min，再取流穿，跑蛋白膠或Bradford粗測，繼續(xù)加入剩下的蛋白液濃縮直到所有濃縮液都加完為止。離心過程中注意是否發(fā)生蛋白沉淀，導(dǎo)致堵管。若發(fā)生沉淀，要確定沉淀的具體原因，是蛋白濃度過高還是Buffer不合適:前者可用多根超濾管同時(shí)超濾，降低濃度的辦法解決，后者的方法是換不同的Buffer，直到蛋白不發(fā)生沉淀為止。
前面幾步用以濃縮蛋白，如果要換Buffer，在總蛋白液濃縮至lml左右的時(shí)候，輕輕加入新的Buffer(經(jīng)0.22um超濾膜超濾)，再濃縮至1ml左右，連續(xù)三次，后一
次的濃縮終體積根據(jù)需要的蛋白濃度而定，-般不多于500u1，也有濃縮至200ul以內(nèi)的情況。按照每次至少10倍左右的體積濃縮算，三次達(dá)到1000倍以上，基本上可以達(dá)到換buffer的目的。
取出蛋白濃縮液的操作在冰上操作，用黃槍頭取，輕輕順著邊緣插入槍頭，輕輕吹打、混勻蛋白液，注意不要碰到超濾膜，然后吸取濃縮液，每次吸接近200ul，直到吸完。管底剩下的后一點(diǎn)濃縮液不必吸取，否則難度太大，有可能損壞超濾膜。后加入MilliQ水到超濾管中，沒過超濾膜，防止膜失水變干。
